Djurforskning: Utforma forskning inom hälsa och biomedicin

The Challenge

Most basic research with animal models focuses on males and excludes females (Zucker et al., 2010; Marts et al., 2004). This creates three problems:

• Less knowledge about disease processes in females due to underutilization of female animals. Results of studies in males are often generalized to females without justification, and even some conditions that occur more often in women are studied in mostly male animals. A gap exists between the proportion of women in patient populations and the proportion of female animals used in testing.
• Inability to use sex as a variable in studies of basic biology (Holdcroft, 2007). In many cases, sex has proven an important variable—for example, in regulation of immune function.
• Missed opportunities to examine female-specific phenomena (such as pregnancy and, in some species, menopause) that often interact with disease progression. Studying pregnancy in model organisms is especially important given the safety concerns about testing in pregnant women.

Method: Designing Health & Biomedical Research

Countries typically have enacted legislation that requires inclusion of women in government-sponsored human studies. For example, the U.S. National Institutes of Health require “that women and members of minorities and their subpopulations” be included in all human subjects research (although sufficient representation of women to allow for sex analysis is required only for Phase III clinical trials—see Policy Timeline). These guidelines, however, rarely apply to studies conducted on animals even though sampling animals of both sexes and of various hormonal states has produced new discoveries that influence drug development and patient care.

Gendered Innovations:

• Studying sex differences in animal models has led to new treatments for traumatic brain injury (TBI), is more common in men than women.
• Accounting for pregnancy, estrous cycle, and menopausal status in animal models has revealed the biological influence of hormones on basic molecular pathways and has been important to understanding certain autoimmune diseases.
• Regulators have considered sex in order to improve animal models for toxicity; this has led to stronger environmental health standards.

Utmaningen

Forskning med försöksdjur har alltid varit viktigt i västerländsk forskning och medicin. Fram till 1960-talet rapporterades sällan könet på försöksdjur, förutom på de djur som användes i reproduktionsförsök. Även idag utelämnas djurens kön "i 22–42 procent av artiklarna i tidsskrifter om neurovetenskap, fysiologi och tvärvetenskapliga ämnen” (Beery et al., 2011).

Analyser av djurstudier där könet rapporterats visar att hondjur är underrepresenterade inom de flesta discipliner, med undantag för reproduktionsbiologi och immunologi – se diagrammet nedan.

Underrepresentation av hondjur

Forskare kan välja att utföra försök på djur av samma kön för att minska kostnaderna för försöken eller i förhoppningen om att kunna minska resultatvariansen (McCarthy et al., 2002). Enkönade försök är det enda alternativet i studier av könsspecifika fenomen (äggstockscancer eller prostatacancer till exempel), och kan också vara en fördel om ett kön är underrepresenterat i tidigare studier eller om det finns starka bevis för att kön inte påverkar resultatet. Majoriteten av enkönade djurexperiment faller dock inte inom dessa kategorier. Hondjur är underrepresenterade i studier av förhållanden som påverkar båda könen och inom forskning där bevis tyder på att könet påverkar resultatet.

Forskare kan undvika användningen av hondjur på grund av hormonnivåer som varierar under brunsten och som kan påverka försöksresultaten (Becker et al., 2005; Wizemann et al., 2001). I vissa fall, dock mer sällan, kan forskare välja att inte använda handjur eftersom aggressiviteten mellan hanar hos vissa arter och stammar gör det svårt att hålla djuren i bur (Gatewood et al., 2006). Hondjur bland gnagare är ibland att fördra i toxikologiska studier på grund av deras större känslighet för vissa gifter (Europeiska kommissionen, 2008).

Innovation med genusperspektiv 1: Könsstudier leder till nya behandlingar av traumatiska hjärnskador

Traumatiska hjärnskador (TBI) är vanligare hos män än kvinnor i både Europa (där den vanligaste orsaken är fordonskollisioner) och USA (där den vanligaste orsaken är skottskador) (Tagliaferri et al., 2006; Wagner et al., 2000; Roof et al., 2000). Nya studier av TBI som inkluderar hondjur har möjliggjort avancerade könsanalyser och förnyat behandlingen av TBI-patienter (se Metod).

Metod: Analysera kön

Könsanalyser börjar när forskare använder djur av båda könen i försök och analyserar data för att avgöra om resultaten för hondjur respektive handjur skiljer sig åt. I djurmodeller för TBI uppvisar hondjuren konsekvent bättre resultat än handjur – honorna är alltså det "mest skyddade" könet och hanarna det "mest påverkade". Den här skillnaden gäller mellan arter och hos en rad naturliga och framavlade musarter (Hurn et al., 2005).

När en könsskillnad en gång observerats kan ytterligare experiment klargöra vari skillnaderna består (Grove et al., 2010) – se Metod nedan.

Gå till Metoder – allmänt

 

Metod: Utforma biomedicinska studier

För att bestämma huruvida det finns eller inte finns en skillnad mellan könen krävs att man tar hänsyn till hondjurs brunstcykel. Om denna inte beaktas kan det finnas könsskillnader som inte upptäcks som en följd av man gjort genomsnittsbedömningar under cykeln (Stoffel et al., 2003). Mekanistiska studier behövs också för att definitivt kunna bedöma könsskillnader eller avsaknaden av sådana i djurförsök. Ett visst läkemedel eller annan yttre påverkan skulle kunna ge samma effekter hos båda könen, men fungera enligt olika mekanismer (Liu et al., 2007). Dessutom kan könsspecifika skillnader få motsatta effekter och neutralisera varandra, vilket förhindrar att de upptäcks (Palaszynski et al., 2005).

Om könsskillnader observeras i en djurmodell är det viktigt att kontrollera inflytandet från könshormoner. Testerna kan inkludera följande:

• Provtagning från hondjur vid olika tillfällen under brunstcykeln. Effektiva studier av fortplantningsdugliga djur inkluderar kontroller av hondjurens brunstcykel. En grundläggande försöksdesign kan omfatta tio grupper av möss: två grupper hanmöss (försöksgrupp och kontrollgrupp) och åtta grupper honmöss (experiment- och kontrollgrupper för var och en av brunstcykelns fyra dagar). Ett enklare alternativ är att inkludera hondjur som representerar endast två delar av cykeln, vanligen östrus och diöstrus (Becker et al., 2005). Dessutom uppvisar vissa däggdjur synkroniserad ägglossning, och hondjur bör hållas åtskilda så att man förhindrar nära kontakt mellan möss som har ägglossning olika dagar (Meziane et al., 2007).

  I djurmodeller för TBI tycks brunstcykeln har liten inverkan på resultatet (Wagner et al., 2004). Men brunstcykelns effekter har varit viktig i studier av immunitetsfunktioner (se Innovation med genusperspektiv 2 nedan).

• Provtagning från hondjur under dräktighet eller skendräktighet. TBI-forskare som tagit prover från hanråttor, icke-dräktiga honor och skendräktiga honor, fanns att ödemen var allvarligast hos hanarna, mindre allvarliga hos icke-dräktiga honor och minst allvarliga hos skendräktiga honor (Roof et al., 1993). Progesteronnivåerna är lägst hos hanarna, högre hos icke-dräktiga honor och högst hos dräktiga eller skendräktiga honor, vilket tyder på att progesteron kan skydda mot ödem (Meffre et al., 2007).
• Artificiell manipulering av hormoner. I djurmodeller för TBI minskar ovariektomi den överlevnadsfördel som hondjur har över handjur. Injektioner av progesteron återställer delvis den här fördelen hos honor som genomgått ovariektomi och förbättrar även överlevnaden hos hanar (Bayir et al., 2004).

Gå till Metoder – allmänt

 

Forskare använde data från djurmodeller för TBI – erhållna genom könsanalyser och prover från hondjur, tagna vid olika hormonella faser – för att ta fram en experimentell behandling för människor. I dubbelblinda kliniska studier uppvisade patienter som fick progesteron kort efter akutbehandling för TBI lägre dödlighet och snabbare tillfrisknande av neurologiska funktioner än kontrollpatienter med liknande skada, och progesteronet var vältolererat (Xiao et al., 2008; Wright et al., 2007). Mer forskning behövs för att

• utvärdera risker och fördelar med progesteronbehandling enligt patientkarakteristika (som kön och ålder) och skadekarakteristika.
• klargöra mekanismerna bakom hur progesteron skyddar mot hjärnskador vid TBI.

Innovation med genusperspektiv 2: Provtagning med fokus på brunstcykler och menopaus ökar grundläggande kunskaper om immunsystemet

Genom att inkludera honmöss i experiment upptäckte forskarna att könshormoner är viktiga för immunsystemets funktion. När honmössen exponerades för antigener och sedan testades under diöstrus och östrus, liknade immunitetsreaktionen i mjälten den man hittade hos hanmöss. Men när honmössen kontrollerades under proöstrus eller metöstrus var antalet antikroppar mer än tre gånger högre än antalet hos hanmöss (Krzych et al., 1978). Genom att korrelera dessa skillnader med koncentrationer av progesteron och östrogen (som också kan variera under brunstcykeln) var det möjligt att få fram vilken effekt könshormoner hade på immunfunktionen (Bergman et al., 1992).

Djurmodeller av menopaus – som fortfarande är under utveckling (se Nästa steg nedan) – har visat att denna hormonella övergång åtföljs av immunologiska förändringar. När möss genomgår ovariektomi och hamnar i "akut menopaus" uppvisar de "reducerad lymfocyt kemotaxis, mitogeninducerad T-cellsproliferationssvar och [Interleukin-2] produktion" (Marriott et al., 2006).

Det är viktigt att förstå hur hormoner och immunförsvar fungerar för att kunna behandla ett antal sjukdomar, däribland autoimmuna sjukdomar och HIV-infektioner. Djurmodeller har exempelvis använts för att undersöka varför HIV-virusmängden tenderar att öka snabbare hos män än hos kvinnor (Meier et al., 2009).

Innovation med genusperspektiv 3: Stärka miljöhälsostandarder

Utöver djurmodellernas användning inom grundforskning och förkliniska tester är de nödvändiga i miljösammanhang och för att utvärdera kemikaliers toxicitet. Europeiska kommissionens Institute for Health and Consumer Protection (IHCP) och amerikanska National Toxicology Program (NTP) har analyserat referensmodeller för att förbättra miljöstandarder (se Metod).

Metod: Ompröva standarder och referensmodeller

Det är viktigt att ta hänsyn till kön i referensmodeller för toxikologi: både försöksdjur och människor uppvisar könsskillnader när det gäller känslighet mot vissa toxiner, och i vissa fall kan en sammansättning ha kvalitativt olika effekter på kvinnor och män, särskilt om sammansättningen är ett hormonstörande ämne (se fallstudien Miljökemikalier).

IHCP använder en "könsbunden recessiv letal test" på bananfluga som muteringsmodell för att kunna screena kemikalier för mutagenisk aktivitet (Europeiska kommissionen, 2008).

Gå till Metoder – allmänt

Standarder och referensmodeller inom EU

Europeiska kommissionens IHCP har bestämda krav på analyser och provtagning som gäller kön (Europeiska kommissionen, 2008):

• Inkludera både hon- och handjur. I tester av inandningstoxicitet instrueras forskare att använda lika antal hon- och handjur för varje koncentrationsnivå. I andra tester föredrar man det kön som är mest känsligt för ett visst toxin, vanligen honor.
• Rapportera studieobjektens kön. Oavsett om ett försök är enkönat eller mixat kräver IHCP att man rapporterar "djurens antal, ålder och kön".
• Ta prover på dräktiga hondjur för att upptäcka utvecklingstoxicitet. Den här metoden gör att forskare kan samla "information om effekterna av det dräktiga försöksdjurets exponering och på utvecklingen av fostret i livmodern".

Standarder och referensmodeller i USA

Amerikanska National Toxicology Program (NTP) kräver könsanalyser vid alla rutinmässiga toxicitetsstudier med djurförsök (NTP, 2006). För analyserna gäller följande krav:

• Rapportera försöksdjurens kön. NTP anger att "data ska föras in i tabeller och struktureras efter art, kön och behandlingsgrupp”.
• Analysera resultat efter kön och rapportera avsaknad av fynd. För alla analyser som utförs inom ramarna för NTP rapporteras förekomst, avsaknad och statistisk signifikans för könsskillnader.
• Analysera faktorer som relaterar till kön. Alla analyser ska kontrolleras mot vikt så att viktskillnader inte felaktigt rapporteras som könsskillnader, eller omvänt.

Konklusioner

Innovationer med genusperspektiv:

• Fysiologi och patofysiologi: Inkluderandet av hondjur i experimentella studier har lett till ny kunskap om traumatiska hjärnskador, vilket resulterat i nya behandlingar. Provtagning med hänsyn till kön och hormonell status har också gett ny kunskap om immunsystemets hormonella reglering, och detta har betydelse för behandlingen av autoimmuna sjukdomar och infektioner. Den här informationen används nu i utvecklingen av behandlingsdoser för vacciner (Klein et al., 2010; World Health Organization, 2010).
• Regler och riktlinjer: Könsanalyser har blivit en viktig del i både EU:s och USA:s ansträngningar att förstå, förebygga och kontrollera miljöföroreningar.

Nästa steg

A. Framtida forskningsbehov:

• Analysera kön på vävnads- och cellnivå. Könsanalyser inom grundforskning har framför allt gjorts i samband med djurförsök, med fokus på hormonellt orsakade könsskillnader. Kön analyseras sällan eller inte alls i studier som involverar odlade celler eller vävnadsprover. En studie av artiklar i tunga, expertgranskade tidskrifter för kardiovaskulära sjukdomar visade att endast 20–28 procent av artiklarna som beskrev forskning om nya cellinjer angav könet på undersökta celler. Av det begränsade antalet studier som rapporterade kön använde 69 procent endast manliga celler (Taylor et al., 2011). Den här skillnaden är ett bekymmer eftersom ny forskning tyder på att studier av cellers kön är viktigt när det kommer till att utveckla stamcellsbehandlingar (se fallstudien Stamceller).
• Analysera faktorer som relaterar till kön för att inte övervärdera könsskillnader. Det är inte alla observerade skillnader mellan handjur och hondjur, celler eller vävnader – eller mellan kvinnor och män – som beror på biologiskt kön. Det är viktigt att man analyserar faktorer som relaterar till kön och genus för att undvika övervärdering av könsskillnader. Viktiga faktorer är kost, hormonnivåer och art. Moderns handlingar kort efter födsel bidrar till könsskillnader i beteendet. Råttmammor beter sig på olika sätt med hon- respektive hanungar, vilket ger utvecklingsskillnader (Moore, 1992).
• Utveckla djurmodeller för menopaus. Det behövs högkvalitativa, validerade djurmodeller för menopaus. Även om primater genomgår menopausliknande processer är svårigheterna med att använda primater och bristen på äldre hondjur en begränsning för forskningen. Menopaus kan induceras kirurgiskt hos försöksdjur genom ovariektomi, som efterliknar bilateral ovariotomi hos kvinnor, men som kanske inte kan jämföras med människans naturliga menopaus (Bellino et al., 2003). Strategier för att skapa modeller för mänsklig menopaus hos råttdjur är att behandla möss eller råttor med läkemedel som orsakar prematur ovarialsvikt och använda transgeniska möss (exempelvis stam Foxo3a-/-) med åldrade äggstockar (Wu et al., 2005).
• Studera genus i djurforskning. Placing female and male animals in different physical and social environments can have marked effects on behavior and experimental outcome, and gender analysis is needed to ensure that housing systems and handling do not create systematic bias (Holdcroft, 2007). In particular, if researchers expect a particular sex difference, they may handle or house female and male animals differently and in such a manner as to produce that sex difference, or they may choose a specific behavioral test likely to produce that difference (Birke, 2011). Housing and handling can determine animal stress levels, which alter both behavioral and biochemical profiles (Beck et al., 2002).När hon- och handjur placeras i olika fysiska och sociala miljöer kan det få tydliga effekter på beteende och försöksresultat, och genusanalys behövs för att säkerställa att inhysning och hantering inte ger upphov till systembias (Holdcroft, 2007). Detta gäller i synnerhet om forskare förväntar sig en viss skillnad mellan könen. De skulle då kunna hantera eller inhysa hon- och handjur olika och på sådant sätt att en könsskillnad frambringas, eller de skulle kunna välja en viss beteendetest som skulle kunna åstadkomma denna skillnad (Birke, 2011). Inhysningen och hanteringen av djuren kan påverka deras stressnivåer, vilket förändrar både de beteendemässiga och biokemiska profilerna (Beck et al., 2002).

B. Nästa steg:

• Kräv av forskare att de rapporterar forskningsobjektens kön. Anslagsgivande organ och tidskriftsredaktörer kan kräva att forskare rapporterar kön för att forskningsprojekt ska finansieras eller forskningsrapporter publiceras. Att rapportera könet på forskningsobjektet förhindrar inkorrekta övergeneraliseringar, underlättar metaanalyser och visar var man förbisett djur av ett visst kön. Stora biovetenskapliga anslagsgivare, bland annat Storbritanniens Medical Research Council (MRC), kräver numera att forskare rapporterar djurens “art, stam, kön, utvecklingsfas […] och vikt”. Stora tidskrifter, som Nature och Public Library of Science publications, har samma krav (National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research, 2008; Kilkenny et al., 2010).
• Kräv studier med båda könen och könsanalyser. Myndigheter kan kräva där så är lämpligt att statligt finansierade studier inkluderar djur av båda könen och att de utformas med "lämpliga samplingsstorlekar" för respektive kön. Offentliga och privata anslagsorgan kan på samma sätt "behandla inkluderandet av hondjur som en fråga om vetenskapliga meriter som påverkar anslagen" (Beery et al., 2011).
• Standardisera användningen av "kön" och "genus" i relation till djurforskning. För närvarande används termerna "kön" och "genus" ofta utan åtskillnad inom djurforskning, vilket gör litteratursökningar och metaanalyser mer komplicerade. Kön och genus är inte samma sak. Ett standardiserat bruk där "kön" refererar till de biologiska egenskaperna som hör samman med kvinnlighet eller manlighet skulle åtgärda problemet (Marts, 2004).

Between 1997 and 2000, 10 drugs were withdrawn from the U.S. market because of life-threatening health effects. Eight of these posed “greater health risks for women than for men.” Not only did these drugs cost billions of dollars to develop, but when they failed, they caused death and human suffering. We can’t afford to get the research wrong.

One reason drugs fail—and fail more often for women—is that, oddly enough, most research is still done in males, whether human, animal, or cells and tissues (see chart).

In research design, both male and female animals should be considered before sex differences are ruled out. Although this increases costs in basic research, it may reduce costs overall—given the high price of developing biomedical therapies. It will certainly reduce human suffering and death.

Countries typically have legislation that requires inclusion of women in government-sponsored Phase III clinical trials. These guidelines, however, rarely apply to studies conducted in animals or cells and tissues. This means that drugs and therapies may be less effective for females and also that anything unique to females will not be seen in the discovery phase of research.

Gendered Innovations:

Sampling animals of both sexes and of various hormonal states has produced new discoveries that influence drug development and patient care.

• Studying sex differences in animal models has led to new treatments for traumatic brain injury (TBI), which is more common in men than women.
• Accounting for estrous cycle, pregnancy, and menopausal status in animal models has revealed the biological influence of hormones on basic molecular pathways and has been important to understanding certain autoimmune diseases.
• Regulators have considered sex in order to improve animal models for toxicity; this has led to stronger environmental health standards.